Результаты исследования: влияние луспатерцепта на микроокружение костного мозга при аллогенной трансплантации

Оценка влияния препарата луспатерцепт на микроокружение костного мозга у пациентов с миелодиспластическим синдромом в контексте аллогенной трансплантации костного мозга с целью поиска потенциальных методов предотвращения отторжения трансплантата и гипофункции трансплантата

Автор: Цветков Николай Юрьевич (врач-гематолог, ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова МЗ РФ, г. Санкт-Петербург)

Миелодиспластические новообразования (МДС) и острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) — это группа гетерогенных клональных заболеваний кроветворной ткани, которые в совокупности являются наиболее частыми показаниями к аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТКМ) у взрослых пациентов. Остаются нерешенными проблемы, связанные с гипофункцией и отторжением трансплантата после ТКМ. Эти проблемы, в том числе, связаны с патологическим микроокружением костного мозга, в котором мезенхимальные стромальные клетки (МСК) активно поддерживают измененные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК). В этом процессе участвуют различные гены, кодирующие как растворимые, так и поверхностные белки клеток. К секретируемым факторам относятся ключевые гемопоэтические цитокины тромбопоэтин (THPO) и фактор стволовых клеток (KITLG), а также основной хемокин, обеспечивающий миграцию стволовых клеток, CXCL12.

Межклеточные и клеточно-матриксные контакты в значительной степени зависят от молекул адгезии, таких как интегрины (ITGB1), кадгерины (CDH2) и члены суперсемейства иммуноглобулинов (VCAM1). Таким образом, необходим поиск эффективных методов профилактики и лечения гипофункции и отторжения трансплантата за счет воздействия на микроокружение.
Препарат луспатерцепт является рекомбинантным гибридным белком, состоящим из модифицированного рецептора активина типа IIB, связанного с Fc-доменом человеческого иммуноглобулина G1. Он связывается с некоторыми лигандами суперсемейства TGF-β, включая GDF-11 и активин B, и восстанавливает эритропоэз на поздних стадиях.

Препарат луспатерцепт уже продемонстрировал эффективность в качестве терапии анемии у пациентов с МДС до этапа ТКМ, воздействуя не только на предшественники эритропоэза, но и на способность МСК поддерживать нормальное кроветворение.
Предполагается, что эти эффекты могут быть также транслированы на микроокружение костного мозга в посттрансплантационном периоде.

В нашем исследовании мы планировали получить экспериментальные данные об активности луспатерцепта в отношении МСК костного мозга как до алло-ТГСК, так и в посттрансплантационном периоде.
 
Методы

В исследование были включены 38 пациентов (18 мужчин и 20 женщин) с установленным диагнозом ОМЛ (n=13) и МДС (n=25), имеющих показания к ТКМ. Медиана возраста составил 52 года (19-65). Медиана времени от постановки диагноза до ТКМ составило 292 дня (43-5342). Медиана времени наблюдения после ТКМ составило 347 дней (14-855). МСК были получены путем выделения мононуклеарных клеток костного мозга пациентов в двух временных точках: до ТКМ (медиана 18 дней (7-72)) и после ТКМ (медиана 55 дней (13-101)), и культивировались в среде αMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотиком. МСК пассажей 2–3 сеяли по 150 000 клеток на лунку площадью 8,87 см 2 в адгезионной культуральной чашке и культивировали в течение 7 дней в двух повторах: экспериментальный образец (с добавлением луспатерцепта в концентрации 10 мкг/мл на лунку) и контрольный образец без добавления луспатерцепта.

После периода культивирования слой МСК удаляли, и общую РНК выделяли в соответствии с протоколом RNA Solo (Helicon). Комплементарную ДНК получали с использованием набора MMLV RT (Helicon). Количественную ПЦР в реальном времени проводили в присутствии специфических праймеров и SYBR Green. Уровни экспрессии мРНК генов ITGB1, KITLG, CDH2, VCAM1, THPO, FLT3 и CXCL12 рассчитывали с использованием метода сравнения порогового цикла относительно референсного гена
ABL1.
 
Результаты

Клинические исходы через год после трансплантации костного мозга в общей группе составили: общая выживаемость (ОВ) 60% (42-74); выживаемость без прогрессирования (ВБП) 50% (33-64); частота прогрессирования 24% (12-38); летальность, не связанная с рецидивом (ЛБР), 27% (14-42). Частота острой реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) на 150-й день составила 29% (16-44), хронической РТПХ через 1 год — 34% (20- 49). Ни у одного пациента не наблюдалось отторжения трансплантата, но 3 пациента
умерли до 30-го дня от инфекционных осложнений. Частота гипофункции трансплантата(необходимость переливания эритроцитов и/или тромбоцитов после приживления) составила 63% (46-76) через 1 год после трансплантации костного мозга.
Только у 23 пациентов был достигнут достаточный рост мезенхимальных стволовых клеток для анализа. В этой группе при сравнении уровней экспрессии генов до ТКМ было обнаружено увеличение экспрессии генов ITGB1, KITLG, VCAM1, CXCL12 (p<0,05) в группе, получавшей луспатерцепт, по сравнению с контрольной группой. При сравнении уровней экспрессии генов после ТКМ было обнаружено увеличение экспрессии генов ITGB1, KITLG, CDH2, VCAM1, THPO, CXCL12 (p<0,05) в группе, получавшей луспатерцепт, по сравнению с контрольной группой.

При сравнении контрольных образцов до и после ТКМ уровень экспрессии генов ITGB1, KITLG, CDH2, VCAM1 значительно увеличился (p<0,05). При сравнении образцов с луспатерцептом до и после ТКМ уровень экспрессии гена KITLG значительно увеличился (p<0,05). В группе пациентов с успешным культивированием МСК наблюдалось значительное увеличение
общей выживаемости (ОВ), выживаемости без прогрессирования (ВБП), частоты развития хронической РТПХ и снижение смертности, не связанной с рецидивом заболевания (p<0,05). Значимой корреляции между экспрессией исследуемых генов и периодом до восстановления показателей крови или количеством переливаний гемокомпонентов после ТКМ обнаружено не было.
 
Обсуждение

Результаты реализации проекта соответствуют заявленной научной гипотезе о том, что культивирование МСК пациентов с МДС до и после ТКМ с применением луспатерцепта приводит к изменению экспрессии генов, участвующих в поддержании гемопоэза. Данное предположение подтвердилось по результатам экспериментов. Однако общая цель работы, заявленная как экспериментальное подтверждение потенциального применения луспатерцепта для предотвращения гипофункции трансплантата и его отторжения у пациентов с МДС после ТКМ, требует дополнительных исследований. В частности, гипотеза о том, что МСК могут стать мишенью для терапевтического воздействия с целью улучшения восстановления кроветворной функции после ТКМ, требует применения более сложных биологических моделей.

В рамках вторичных конечных точек был произведён сбор клинических данных о восстановлении уровней нейтрофилов, лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови на 30-й и 60-й день после ТКМ, а также о результатах цитологического 
исследования костного мозга на 30-й и 60-й день после ТКМ. При этом значимой корреляции экспериментальных и клинических данных выявлено не было, что может говорить о недостаточно большой группе пациентов, включенных в исследование, а также
их гетерогенности.

В качестве первой ключевой контрольной точки проекта был запланирован отбор репрезентативной группы пациентов с МДС, у которых будут взяты образцы костного мозга. Планировалось включить в исследование 30 пациентов старше 18 лет с  подтвержденным диагнозом первичного МДС согласно критериям ВОЗ 2017 года, которым впоследствии будет проведена ТКМ в ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Однако в ходе работы возникли трудности, связанные с большим
количеством пациентов, неподходящих для включения в исследование в соответствии с заявленными критериями исключения (вторичный МДС, связанный с предшествующей лучевой и химиотерапией; предшествующая ТКМ; МДС, связанный с делецией 5q;
применение азацитидина, децитабина, талидомида, леналидомида, Г-КСФ или луспатерцепта, или любого другого экспериментального препарата в течение 8 недель до включения в исследование). Также значительное время потребовалось для отработки и адаптации экспериментальных методик, в первую очередь, связанных с культивированием МСК. Это увеличило число и охват включенных в исследование пациентов (в исследование также были включены пациенты с ОМЛ), и привело к тому, что период до выполнения первой ключевой точки составил больше запланированного, что потребовало изменения порядка и продления сроков использования гранта для завершения последующих контрольных точек: оценки экспрессии генов в МСК из образцов костного мозга пациентов с МДС и анализа полученных данных, которые удалось выполнить в новые сроки.

Изначально в качестве первичной конечной точки планировалось оценить влияние луспатерцепта на уровень экспрессии генов, регулирующих функцию микроокружения гемопоэтической ниши (FL, TPO, SCF, SDF1α, N-кадгерин, Cx43, VCAM-1, ITGB1). В
процессе работы гены FL и Cx43 были исключены в связи с техническими сложностями, связанными с оптимизацией протокола полимеразной цепной реакции. Дополнительно планировалось использовать клеточный сортинг с соответствующей панелью антител для выделения МСК из костного мозга, однако в последующем от этой идеи было решено отказаться в пользу классического культивирования в связи со сложностью адекватной иммунофенотипической идентификации популяции МСК. Также по техническим причинам было принято решение проводить оценку только в одной точке после ТКМ, при этом сроки взятия образцов костного мозга как до, так и после ТКМ адаптировались по клинической ситуации.
 
Выводы

Поскольку в настоящее время единственным терапевтическим вариантом, обладающим потенциалом излечения пациентов с МДС, является ТКМ, улучшение результатов является ключевой проблемой, которую потенциально можно решить, воздействуя на строму костного мозга. Таким образом, использование луспатерцепта в посттрансплантационном периоде может улучшить исходы ТКМ. Данные исследований in vitro демонстрируют способность луспатерцепта увеличивать экспрессию генов, ответственных за поддержку гемопоэза, в МСК костного мозга пациентов с МДС и ОМЛ как до, так и после ТКМ. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения этих результатов и определения клинической значимости применения луспатерцепта после ТКМ.
 
По результатам выполнения проекта планируется публикация оригинальной статьи (Cellular Therapy and Transplantation, 2-3 кварталы 2026 г.). В рамках подготовки публикации планируется дополнительный анализ полученных результатов и
сопоставление с данными литературы. На основании этого рабочей группой планируется обсуждение перспективности продолжения исследования с учётом имеющихся ресурсов, поиск дополнительного финансирования при необходимости. В частности, планируется анализ целесообразности выполнения дополнительных лабораторных этапов для увеличения объёма экспериментальных данных либо перехода к организации клинического этапа исследования.

---